Neonatal Diagnóstico y Tratamiento …

Neonatal Diagnóstico y Tratamiento ...

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Figura 1 Valor diagnóstico de Neuroquímicos de plasma para la detección neonatal de la enfermedad de Menkes.

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Una prueba prometedora para el diagnóstico neonatal de la enfermedad de Menkes consiste en la medición de la dopamina neurotransmisores, noradrenalina, ácido dihidroxifenilacético, y dihidroxifenilglicol en el plasma. 17 A causa de disminución de la actividad de la dopamina-β-hidroxilasa, la relación de ácido dihidroxifenilacético a dihidroxifenilglicol se eleva claramente en pacientes con enfermedad de Menkes. 18 A partir de los caminos conocidos de síntesis de catecolaminas y el metabolismo (Figura 1 Figura 1 Valor diagnóstico de Plasma Neuroquímicos para la detección de la enfermedad de Menkes Neonatal.), También se podría predecir una alta proporción de la dopamina a noradrenalina.

métodos

Asignaturas

En un grupo de control histórico de 15 pacientes de finales del diagnóstico (edad media [± DE] al momento del diagnóstico, 163 ± 113 días y el rango de 42 a 390) también tratado en el NIH con el mismo régimen de cobre, la identificación se basa en el clásico clínica y hallazgos bioquímicos (cobre sérico bajo y ceruloplasmina después de la edad de 3 meses). 4 El intervalo desde el diagnóstico hasta el inicio del tratamiento de cobre en estos pacientes varió, dependiendo del momento de su remisión a este estudio. Cinco pacientes recibieron tratamiento durante 3 años, y 10 murieron antes de poder completar 3 años de tratamiento. La duración media del tratamiento de estos últimos pacientes fue de 12,2 meses (rango, 4,0 a la 18,0).

Los análisis de los valores plasmáticos y neuroquímicos ATP7A Las mutaciones

Los análisis de los valores de plasma y neuroquímicos ATP7A Las mutaciones se realizaron en nuestro laboratorio como se ha descrito previamente 16,18 virtud de las normas y condiciones certificados de acuerdo a las de Laboratorio Clínico. La secuenciación de ADN implicado ATP7A los exones y límites de exón y se llevó a cabo en ambas direcciones.

Ensayo de complementación de levadura

El análisis inmunohistoquímico y microscopía confocal

Polimerasa transcriptasa inversa-reacción en cadena de Análisis

Fibroblastos se extrajo el ARN con un kit RNeasy (Qiagen). En primer capítulo de síntesis se llevó a cabo con un kit aviar primer capítulo de síntesis mejorada (Sigma). Reverse-polimerasa-transcriptasa-reacción en cadena (RT-PCR) para análisis de mRNA se llevó a cabo con los cebadores 5′-GAAGGATCGGTCAGCAAGTC-3 ‘del exón 8 (hacia delante) y 5′-GGTTGCCAGCACAATCAGTA-3’ del exón 10 (inversa), lo que generó un producto normal de 363 pb.

Se obtuvo la línea de base y los electroencefalogramas de seguimiento para los 12 recién nacidos incluidos en el ensayo de un tratamiento temprano. La mayoría de los pacientes se sometieron a cuatro o más electroencefalogramas. Los trazados fueron consideradas anormales si cualquiera de los siguientes hallazgos estaban presentes: Fondo ralentización o desorganización, las ondas de pico o polipuntas, o complejos-y-pico de ondas lentas difusas.

Se obtuvieron exploraciones de resonancia magnética del cerebro usando T1 – y T2 -técnicas ponderados, así como de recuperación de inversión atenuada de flujo. Los pacientes se sometieron a tres exploraciones. Evaluamos estos estudios para determinar la presencia de anomalías estructurales del cerebro y la progresión de la mielinización de la materia blanca.

Diseño del estudio y análisis estadístico

resultados

El diagnóstico prospectivo con análisis de plasma de catecolaminas

Las concentraciones medias en plasma de ácido dihidroxifenilacético, dopamina, norepinefrina y dihidroxifenilglicol difirieron entre los lactantes en riesgo en los que el fenotipo de la enfermedad de Menkes no se desarrolló (35 hijos) y los determinados posteriormente tener la enfermedad de Menkes acuerdo con, bioquímicos séricos de cobre clínica (baja y ceruloplasmina en gt; 3 meses de edad), o los criterios moleculares (46 recién nacidos) (PLT; 0,001 para todas las comparaciones) (Tabla 1). En afectada en comparación con los pacientes no afectados, la dopamina y los niveles de ácido dihidroxifenilacético eran más altos y los niveles de norepinefrina y dihidroxifenilglicol eran más bajos. Las proporciones de dopamina a noradrenalina y el ácido dihidroxifenilacético a dihidroxifenilglicol difirieron entre los bebés afectados y no afectados (PLT; 0,001 para ambas comparaciones).

Entre los recién nacidos en riesgo 1 mes de edad o menos (Tabla 1), un gráfico de dispersión de dopamina a noradrenalina en comparación con ratios de dihidroxifenil-ácido a dihidroxifenilglicol (Figura 1A) distinguirse claramente afectados desde bebés no afectados. Los análisis de ROC mostró una estadística C de 1,0 para la dopamina plasma y 0,96 para el ácido dihidroxifenilacético plasma (Figura 1B), resultados que indican una alta sensibilidad y especificidad.

Los hallazgos moleculares y bioquímicos en los recién nacidos asintomáticos

De los 14 recién nacidos con altos ratios de dopamina tanto a la norepinefrina y ácido dihidroxifenilacético a dihidroxifenilglicol, 12 fueron incluidos en un ensayo clínico de inyecciones diarias de cobre. Los dos niños no inscritos nacieron fuera de los Estados Unidos; la familia de uno de estos pacientes se redujo el tratamiento, y el otro paciente recibió tratamientos de cobre y de inyección en su hospital local. hallazgos bioquímicos y clínicos posteriores indicaron el diagnóstico de la enfermedad de Menkes en estos pacientes, tanto de los cuales murieron dentro de los primeros 2 años de vida. No se realizó el análisis de mutaciones en estos dos bebés.

Tabla 2 Tabla 2 Características de los 12 pacientes que recibieron un diagnóstico de la enfermedad de Menkes como asintomática recién nacidos. resume las mutaciones y los datos bioquímicos posteriores al tratamiento para los 12 pacientes del ensayo clínico. Se identificaron 10 mutaciones diferentes. Los niveles séricos de cobre obtenidos fueron superiores a los de los niños con enfermedad de Menkes sin tratar 26, salvo en dos pacientes (pacientes de entre 2 y 11). Todos los pacientes ensayados mostraron mayores niveles de β urinaria2 -microglobulina, un marcador sensible de daño tubular renal. 27

La supervivencia de los lactantes que recibieron el diagnóstico temprano y tratamiento

Se comparó la supervivencia entre la cohorte que recibió el diagnóstico y tratamiento precoz (media de edad del primer tratamiento, 10 ± 4 días), con el que, entre un grupo control histórico de 15 pacientes con enfermedad de Menkes también seguido en el Centro Clínico de los NIH que recibieron un diagnóstico y fueron tratados más tarde en la infancia (edad promedio al momento del diagnóstico, 163 ± 113 días). La supervivencia fue del 92% después de una mediana de seguimiento de 4,6 años entre los pacientes tratados con el cobre temprano y 13% después de una mediana de seguimiento de 1,8 años en el grupo de control de pacientes que fueron tratados tarde.

Se han detectado anomalías electroencefalográficas en 7 de 12 pacientes (58%), aunque sólo 2 tenían evidencia de crisis clínicos. Los hallazgos anormales incluyen enlentecimiento de fondo o desorganización, enlentecimiento focal (principalmente en la región posterior de la cabeza), las ondas de pico focales o polipuntas (predominantemente en la región occipital), y los complejos-y-pico de ondas lentas difusas. anomalías distintas en cerebro de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), incluyendo atrofia cerebral y cerebelosa cortical y la mielinización retardada, eran evidentes en seis de los nueve pacientes estudiados. Dos pacientes (pacientes de 5 y 8) tuvieron exploraciones normales de resonancia magnética del cerebro de serie.

Caracterización de mutaciones

Para seguir haciendo frente a la variabilidad en la respuesta al tratamiento temprano de cobre entre estos pacientes, que caracteriza varias mutaciones representativas. Estos eliminación incluido del exón 1 (paciente 2), la deleción de los exones 20 a 23 (paciente 12), la mutación de sentido erróneo (G666R pacientes de 4 y 8), y la alteración de empalme cruce IVS9 (paciente 5). No caracterizamos Q1385X (paciente 10), ya que la consecuencia predicha de esta mutación sin sentido es similar al de la deleción de los exones 20 a 23.

experimentos de RT-PCR usando ARN de fibroblastos de paciente 5 y su profundamente alterada hermano mayor dan a conocer que el efecto principal de IVS9, DS, + 6 T → G es la omisión del exón 9 (Figura 3A Figura 3 Caracterización de ATP7A Las mutaciones en una cohorte Early-Tratamiento de pacientes con enfermedad de Menkes. ). Exón 9 contiene 226 pb de la ATP7A secuencia, que codifica los dos primeros segmentos transmembrana en el producto génico. 9 Además de este transcrito mutante, se detectó una pequeña cantidad de la transcripción adecuadamente empalmados en ambos pacientes.

Se utilizó un ensayo de complementación de levadura 22 para estudiar los efectos de la deleción de los exones 20 a 23 y G666R sobre la función ATP7A. Los resultados indicaron que G666R complementa parcialmente el S. cerevisiae cobre y el transporte nocaut ccc2 eliminación, lo que indica una cierta capacidad de transporte de cobre y funcional residual en este alelo mutante (Figura 3B). En contraste, el alelo mutante con deleción de los exones 20 a 23 no para complementar la supresión ccc2, lo que implica la ausencia de cualquier función de cobre y transporte residual. Transformación de eliminación ccc2 con un alelo mutante (N1304S) señaló anteriormente que tienen actividad ATPasa de cobre residual 22 y con un vector vacío, como controles positivos y negativos, respectivamente, dio los resultados esperados (Figura 3B).

Exón 1 de ATP7A es no codificante; supresión de este exón puede incluir la ATP7A promotor y por lo tanto eliminar la expresión del gen. 28 Se utilizó el análisis de inmunohistoquímica y microscopía confocal para evaluar ATP7A expresión en cultivos de fibroblastos de paciente 2, que tenía una deleción del exón 1, y no encontró ninguna señal detectable (Figura 3C).

Discusión

Los pacientes que completaron el ensayo no han mostrado disminuciones en neurológico o habilidades cognitivas después de la terminación del tratamiento. Este es también el caso de un paciente que se informó anteriormente, el 12 que permanece vivo y bien a la edad de 13 años sin impedimentos neurológicos o cognitivos 10 años después de la interrupción del tratamiento.

Los avances en la comprensión de los aspectos clínicos, bioquímicos y moleculares de la enfermedad de Menkes han superado a los avances en el diseño de terapias eficaces para todos los pacientes con este diagnóstico. Dado que la respuesta óptima al tratamiento de cobre y de inyección parece ocurrir sólo en pacientes que han sido identificados en el período neonatal y cuyas mutaciones permitir la actividad de transporte de cobre y residual, enfoques adicionales, incluyendo ATP7A la transferencia de genes, son futuras consideraciones pertinentes.

No se informaron conflictos de intereses pertinentes a este artículo.

Agradecemos a los pacientes y sus familias por su participación, los médicos peticionarios para el cuidado de expertos y una manipulación rápida de muestras de plasma de los lactantes, Alan Hinnebusch para las cepas de tipo salvaje y supresión de ccc2 S. cerevisiae, Betty Eipper para el anticuerpo de conejo para el extremo carboxilo terminal de ratón ATP7A, Nina Cuerno de la línea celular de fibroblastos de pacientes de II-2, Lynnette Nieman para el cuidadosa revisión del manuscrito, y Owen Rennert útil para muchos debates.

fuente de información

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