Antígeno Viral VIH Ensayos de detección de VIH.

Antígeno Viral VIH Ensayos de detección de VIH.

La prueba del antígeno del VIH se utiliza actualmente para el cribado de sangre para transfusión y es apropiado para su uso en otras varias situaciones de prueba. Ofrece las ventajas de la simplicidad y la rentabilidad para la verificación de la infección, pero es menos que perfecto.

El ensayo del antígeno p24 mide la proteína p24 de la cápside viral (núcleo) en la sangre que es detectable antes de anticuerpos contra el VIH durante la infección aguda. Se produce poco después de la infección debido enel ráfaga inicial de la replicación del virus y se asocia con altos niveles de viremia durante el cual el individuo es altamente infeccioso. (1) Cuando los anticuerpos contra el VIH se hacen detectables, sin embargo, el antígeno p24 es a menudo ya no demostrable, lo más probable debido a la complejación de antígeno-anticuerpo en la sangre. Cuando se detecta, el antígeno p24 es altamente específico para la infección. La especificidad de la prueba del antígeno p24 en la detección de la infección por VIH mediante PCR como patrón de referencia se calcula a partir de los datos utilizando los kits de prueba de 2 fabricantes de 99,9%. (2) En el mismo estudio, la sensibilidad después de un procedimiento de neutralización para confirmar la presencia de antígeno p24 (véase más adelante) fue del 100%.

Las pruebas de p24 puede ser de valor en:. (1) la detección de la infección temprana por VIH, (2) analizar la sangre, (3) el diagnóstico de la infección en el recién nacido, (3) y (4) el seguimiento de la terapia antiviral (4) Una limitación importante es que la prueba es insensible al probar la sangre, tanto por bajos niveles de antígeno son difíciles de detectar, y porque antigenemia se produce sólo transitoriamente durante las diferentes etapas de la infección. (5) de hecho, la prueba del antígeno del VIH es incapaz de detectar 75% de la sangre donantes que están infectadas pero seronegativos (6).

La detección del antígeno p24 y otros marcadores tempranos durante la infección

El momento exacto en que, el antígeno, y el anticuerpo se puede detectar el ARN del VIH depende de varios factores, incluyendo la prueba utilizada, las respuestas del huésped individuales, y las características virales. El ARN viral se puede detectar en las primeras 2 semanas utilizando el método de RT-PCR de alta sensibilidad. Antígeno, aunque transitoria, puede aparecer tan pronto como 2 semanas después de la infección y dura de 3 a 5 meses. (8) ensayos de anticuerpos de nueva generación, incluyendo los ensayos de anticuerpos antígeno-sándwich de tercera generación del VIH, puede detectar anticuerpos en la mayoría de las personas en alrededor de 3 a 4 semanas después de la infección. (9) Latein el curso de la infección, es decir, como la progresión a SIDA se produce, anti-p24 disminuye de anticuerpos y antígeno p24 de nuevo se vuelve detectable. (10) la disminución de anticuerpos frente a p24, la producción de antígeno, y la generación de complejos inmunes son más probable en relación a los cambios en la replicación viral, (11) ya que los anticuerpos a otros componentes (por ejemplo, sobre las glicoproteínas) persisten a lo largo de la infección. (12)

Usos de la p24 Prueba de antígeno

La prueba del antígeno p24 es más útil en la detección de antígeno en sobrenadantes de cultivos que han sido inoculados con células de un paciente sospechoso de estar infectado (cultivo viral y aislamiento). La prueba de antígeno es el método de elección para detectar la presencia de antígeno libre en la cultura, y es dos órdenes de magnitud más sensible que el ensayo de la transcriptasa inversa. (13) La prueba es más útil para la detección de antígeno viral en los fluidos de cultivo porque grande cantidades de antígeno son exudados en el líquido sobrenadante durante la replicación viral.

La prueba del antígeno se puede realizar en fluidos que no sean los de la cultura y el suero. Evidencia determinada a partir del análisis de líquido cefalorraquídeo (LCR) indica que muchos pacientes con demencia por VIH y la encefalopatía tienen antígeno detectable en el LCR, muy probablemente debido a la replicación activa del virus en el tejido cerebral.

La prueba del antígeno p24 puede ser de valor en el cribado de la sangre, para la identificación de la infección aguda, para seguimiento de la infección, andto ayudar en el diagnóstico de la infección en el recién nacido (cada uno se discute posteriormente). Se ha utilizado para la detección de la infección temprana en casos de violación, la identificación de la infección después de la exposición ocupacional, y para ayudar en la resolución de los resultados indeterminados de Western blot. El grado en que los ensayos de antígeno p24 pueden detectar antígeno p24 de todos los clados de VIH-1, VIH-2 y VIH-1 Grupo O, sin embargo, es desconocido.

Este mandato para reducir el riesgo de infección por transfusión inducida ha generado polémica, debido a que el costo de los exámenes de rutina de los donantes de sangre para el antígeno p24 puede estar en los 100 millones de dólares por año oscilan, un coste muy por encima de otras intervenciones de salud. (16 )

La identificación de la infección aguda

La identificación de la infección temprana permite a la institución de la terapia temprana (que ahora está disponible), con lo que potencialmente disminuir la diseminación del virus. Muchos laboratorios clínicos están usando pruebas rápidas de anticuerpos del VIH para detectar la infección en el paciente fuente siguientes casos de exposición con el fin de instituir la terapia a la mayor brevedad después de la exposición. En pacientes fuente de alto riesgo que son seronegativos, el ensayo del antígeno p24 puede ser utilizado de manera similar para la detección de la infección temprana por lo que el tratamiento puede ser instituida en un marco de tiempo que es clínicamente relevante.

Las pautas del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos desalientan el uso de las pruebas de rutina para el antígeno p24 en configuraciones distintas de los bancos de sangre y de plasma como un método para el diagnóstico de la infección por el VIH debido a que el tiempo medio estimado de la detección del antígeno p24 para la detección de anticuerpos del VIH es de 6 días, y no todas las personas infectadas recientemente tienen niveles detectables de antígeno p24. (18)

Monitoreo de la Infección por VIH

La detección de la infección en el recién nacido

El diagnóstico de la infección por VIH en el recién nacido es problemático debido a la omnipresencia de anticuerpos del VIH de la madre durante el primer año de vida. Prueba de la recién nacido inevitablemente resulta en la detección de anticuerpos maternos, tanto con el recién nacido y la madre que tiene perfiles de anticuerpos idénticos. Después de aproximadamente 12 meses, los anticuerpos maternos se desvanece en el recién nacido y un diagnóstico basado en anticuerpos del recién nacido se hace posible. Un recién nacido debe ser monitoreada mediante pruebas de anticuerpos para un máximo de 18 meses, sin embargo, porque incluso después de los anticuerpos maternos desaparece, puede ser varios meses antes inmunológico iscompetent sistema del recién nacido suficiente para producir anticuerpos. De hecho, un recién nacido infectado cuyos anticuerpos maternos ha desaparecido a los 12 meses puede llegar a ser seropositivos a los 18 meses. En algunos casos, la demostración de un aumento del título de anticuerpos en el tiempo en el recién nacido puede sugerir verdadera infección.

La sensibilidad de la prueba del antígeno p24

antígeno p24 no se puede detectar fácilmente (especialmente en las infecciones asintomáticas) debido a que su concentración en el suero puede ser baja debido a la baja la replicación viral. La prueba del antígeno isrelatively insensible, ser capaz de detectar sólo alrededor de 10 pg / ml de antígeno p24. Esta cantidad de antígeno puede no estar presente en el suero de individuos infectados, incluso cuando el virus se está replicando activamente. De hecho, sólo alrededor del 50-60% de los pacientes con SIDA, de 30 a 40% de (ARC) pacientes complejos relacionados con el SIDA, y 10% de los pacientes asintomáticos tendrán antigenemia p24.

Además, el grado de antigenemia parece variar en función de la población analizada. Por ejemplo, varios estudios han demostrado que los pacientes africanos con SIDA tienen mayores niveles de antígeno de un grupo similar de individuos en los Estados Unidos. (26) Por el contrario, los pacientes africanos infectados por el VIH, pero que son asintomáticos han demostrado tener niveles más bajos de antigenemia p24 que un grupo similar en los Estados Unidos.

Una razón de la falta de sensibilidad de la prueba de antígeno cuando se prueba el suero de personas infectadas por VIH es que el antígeno p24 libre en el suero puede complejarse con anticuerpo p24. La prueba no puede detectar antígenos complejados. Incluso con disociación complejo, sin embargo, la sensibilidad sigue siendo baja y la prueba sólo puede detectar aproximadamente el 50% de los pacientes asintomáticos. (7)

p24 Metodología Prueba de antígeno

Principio del ensayo

La confirmación de la presencia del antígeno p24

Las pruebas de antígeno p24 están sujetos a reacciones de falsos positivos, presumiblemente debido a las sustancias que interfieren y complejos inmunes. Por lo tanto, las muestras que ponen a prueba positivo en la prueba del antígeno deberán ser confirmadas, utilizando un método más específico. Ensayo de neutralización Anantigen se utiliza para verificar la especificidad. Este método de neutralización se compra como reactivos suplementarios para el ensayo del antígeno p24. El suplemento incluye un reactivo de neutralización se utiliza en una etapa de pretratamiento antes de repetir la prueba del antígeno p24.

Debido a que todos los ensayos se realizan por duplicado o cuadruplicado, se requiere cerca de 1 ml de suero para completar la prueba para obtener un resultado final confirmada. La prueba también es relativamente caro, al menos dos veces tan caro como las pruebas de anticuerpos. Además, dependiendo del número de repeticiones sea necesario y el número de muestras thetotal siendo probado, los costes pueden ser exorbitantes. Un protocolo para un ensayo de antígeno p24 en casa diseñado para probar un gran número se ha descrito y es más rentable que los ensayos disponibles en el mercado. (27)

La cuantificación de p24

Para determinar los niveles de antígeno p24 en la sangre, un estándar de antígeno del VIH-1 se diluye para preparar una serie de seis niveles de concentraciones variables. Las concentraciones varían entre 0,0 y 125 pg / ml. Una curva estándar se genera a partir del cual los valores de densidad óptica de las muestras desconocidas se interpolan para determinar su concentración. La curva estándar se construye utilizando un gráfico lineal y representando gráficamente la concentración del patrón de antígeno de VIH-p24 (pg / ml) en el eje X frente a las densidades ópticas medias para cada estándar sobre el eje y. se añade Cada estándar en pocillos duplicados, y al menos 5 controles debe ser incluido (3 negativos y 2 positivos). Si el valor de la muestra desconocida es mayor que el valor del más alto nivel, la muestra debe ser diluida en el suero humano normal y se repite todo el procedimiento de neutralización.

El aumento de la sensibilidad de la detección (Inmune compleja disociación)

Para mejorar la sensibilidad del ensayo del antígeno p24, los fabricantes introdujeron un procedimiento inmunológico disociación Complex (ICD) usando pH bajo para disociar los complejos de antígeno p24 / anti-p24antibody antes de realizar el ensayo de antígeno. Usando este procedimiento, se demostró un aumento de la sensibilidad del ensayo, en particular para los individuos asintomáticos infectados por el VIH. Este procedimiento de disociación permite la detección tanto de antígeno p24 libre y antígeno p24 / anticuerpo acomplejado. El método no sólo aumenta el número de individuos positivos de antígeno (sensibilidad epidemiológica), pero también puede detectar cantidades más bajas de antígeno p24 (sensibilidad analítica). (28) Aunque ICD puede resultar en un aumento global de la sensibilidad de la prueba de antígenos, la detección de todas las personas infectadas por el VIH es sólo alrededor del 50%.

Interpretación de resultados

Para validar que la prueba del antígeno p24 cuantitativa ha actuado como se esperaba, la lectura de la densidad óptica de la norma debe cumplir con ciertos criterios. Estos criterios pueden variar según el fabricante, pero por lo general requieren que la densidad óptica media de la norma 0 pg / ml y el blanco del substrato debe ser inferior a 0,100, y el valor de la densidad óptica media de la norma 62,5 pg / ml debe ser mayor que o igual a 0,500.

Limitaciones del antígeno p24 Ensayo

Debido a la posibilidad de una rápida degradación del antígeno p24 del VIH-1 en las muestras almacenados inadecuadamente, las personas que tienen resultados indeterminados de neutralización deben analizarse de nuevo utilizando una nueva muestra. Las causas más comunes de una prueba de neutralización indeterminado (cuando no se cumplen los criterios) son: reacción no específica de una persona no infectada, los bajos niveles de antígeno p24 en una persona infectada, o el deterioro de la muestra o la formación de complejos antígeno-anticuerpo durante el almacenamiento (18).

Evaluar la competencia para la prueba de antígenos p24

La Oficina de Práctica de Salud Pública de la División de Sistemas de laboratorio de los CDC ha puesto en marcha un programa de laboratorio Evaluación del Desempeño (PE) para evaluar el rendimiento de las pruebas de antígeno p24. (30) Los participantes reciben grupos de evaluación de los sueros de dos veces al año e informar de los resultados a los CDC. El CDC continuación, prepara y distribuye informes a los laboratorios participantes que describen la idoneidad de sus prácticas de prueba. El programa es voluntario y de forma gratuita (número de teléfono, 770-488-4366).

Normas para el Control del rendimiento externos

Es conveniente incluir un control externo al realizar el ensayo de antígeno p24. un control de este tipo, diferente de los controles internos incluidos en el kit de prueba, proporciona un medio para validar el procedimiento completo (incluyendo la capacidad de los controles internos para producir valores de corte apropiados), y para controlar intra-plazo, entre otras carreras, y kit de prueba de lote a lote variaciones. Una descripción detallada del uso de los controles externos para este propósito ha sido publicado. (12) Una variedad de normas para las pruebas de antígeno p24 están disponibles. (31)

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